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RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范

2021/12/24 13:35:28??????點擊：

Real-Time qPCR（RT-qPCR）優點眾多，目前已成為生命科學領域的一項常規技術，越來越多的研究文章中涉及到RT-PCR實驗，也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十幾年來，RT-qPCR的論文大量發表，仍面臨著專業規范的問題。

主要表現在以下兩個方面>>

01 70%-80%提供數據仍不采用PCR實驗指南（MIQE）數據規范及實時定量PCR數據的結構化語言和報告指南（RDML）語言規范，表達不規范、說服力不足、結果表述不清、數據無法重復等問題導致被撤稿。

02 追求試劑“低價”或“品牌崇拜”，缺乏科學的試劑質量評價方法，方法體系的不嚴謹將造成錯誤的結論。

2017年Stephen Bustin等調查顯示——說一套，做一套，RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范。（Talking the talk, but not walking the walk：RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch）作者指出許多分子生物學研究缺乏重現性的根本原因是分子測量方法報告不充分。RT-qPCR是RNA定量最直接的測量技術之一，廣泛應用于研究、診斷、法醫和生物技術應用，盡管定量PCR實驗指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR數據報告的規范性和透明度，但調查顯示錯誤的試驗方法、不適當的數據分析和不充分的報告仍然普遍存在，大多數已發表的RT-qPCR數據可能造成實驗結論誤導。

結果再現性問題

2013年，《自然》(Nature)雜志發表的一篇論文綜述得出結論，自MIQE指南發布以來，有關RT-qPCR方案的必要信息的報告實際上有所惡化。雖然指南強烈建議納入必要的技術信息，但分析的10篇論文中沒有一篇報道了這一信息。這意味著沒有向讀者提供任何有關RNA完整性、RNA純度、RT條件或PCR效率的信息，而且所有的出版物都使用了一種不恰當的數據分析方法，這種方法在15年前已經被質疑。作者對《自然》雜志的20篇近期論文進行了重復分析，得出了基本相同的結論。更諷刺的是，報道透明度與期刊的影響因子呈負相關。

研究RNA表達的方法

RNA圖譜分析依賴于多種方法，有些方法相對簡單，有些方法則復雜得多，有些方法限制于低通量，還有一些方法允許并行處理大量樣本。作者對目前使用的主要RNA分析方法進行了簡要概述，闡述了許多使用基于RNA的方法發布的數據的可靠性和生物/臨床相關性引發激烈辯論的問題，并闡明了導致這些結果不可靠且需要修正的各種原因

01PCR是目前大多數使用的方法，而使用凝膠電泳進行PCR分析仍在繼續使用。對PCR相關衍生的問題的認識由來已久，早在1992年就有第一份報告描述了實驗室內和實驗室之間對復制和連續標本進行評估的不一致性。缺乏一個涉及PCR的動態過程的理論理解，特別是關于不可復制或意想不到的擴增產物的擴增，在幾十年前也被強調。這些觀察結果和由此產生的影響在很大程度上被忽略了。
02

qPCR和RT-qPCR是快速、簡單定量核酸的方法，并繼續被廣泛使用，2016年PubMed搜索逆轉錄實時PCR或RT-qPCR或qRT-PCR，有近5400個引用。但是該方法的再現行。可靠性和一致性收到質疑，

微陣列技術與RT-qPCR相比可以處理更多的樣本，比但由于執行和分析數據所需的復雜性和時間的增加，這種方法的流行度正在下降，2016年PubMed搜索“微陣列”一詞大約有1600個引用。

RNA-seq是所有RNA profiling方法中技術最復雜、最昂貴、最耗時的一種，使得復制或重復實驗的可行性較低。

另外兩種中等通量的RNA分析方法是NanoString公司的nCounter分析系統和Thermo Fisher公司的OpenArray系統。前者的優點是不需要RT步驟，后者減少了所需的樣品處理量。比較兩種技術和RT- qPCR的mRNA豐度分析發現，三種方法的結果具有廣泛的可比性。然而，盡管NanoString和OpenArray的結果有很好的相關性，但RT- qPCR數據與兩者有顯著差異。作者將其歸因于常規RT-qPCR需要大量的移液操作，從而增加了樣品制備的可變性。這些結果也表明，即使以適當的方式進行了技術和分析，結果也可能是不一致的。這也存在一種可能，即RT-qPCR結果是正確的，而其他兩種方法得到的結果是錯誤的。

RT-qPCR存在的問題

RT- qPCR工作流程表面上簡單的結果是，一方面，許多未經培訓和不熟練的操作人員采用了這項技術。另一方面，不知道從哪里查找并識別問題所在，確定報告的結果是否可能是真實的。下面概述了妨礙對結果進行一致解釋的方法問題，并舉例說明了為什么報告的結果常常如此不可靠。

01RNA的質量

相關的質量控制措施是任何分子生物學實驗前的必要準備工作，包括確保可靠的qPCR檢測。RNA在提取和保存過程中有各種物理和化學因素的降解核酸，因此純度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的總RNA可以劃分為優質RNA，大于8的RNA可以劃分為完美RNA。這并不是一個理想的分類，因為降解與抑制類似，它不是一個恒定或穩定的過程，而是以不同的方式影響轉錄。這種不一致的一個嚴重后果是，對純度或降解程度不同的樣品進行比較，可能會顯示出差異，實際上并沒有差異，或者掩蓋了任何實際差異。這種不一致性直接影響基因表達結果，從而會影響實驗結論。

02逆轉錄步驟

在首次PCR實驗報道后不久，結合RT和PCR步驟檢測RNA靶點的潛力就被發現了，并在隨后不久被建議將其用作定量分析。隨后發現，定量RNA并不像定量DNA那樣簡單，比如RNA逆轉錄后通過PCR進行擴增取決于RNA濃度和引物設計以及在引物結合位點避免大量的二級結構，不同的RT酶受到這些二級結構的不同影響。逆轉錄步驟實際上是可變的，因為它是由不同的實驗人員進行的，實驗人員使用了不同數量的RNA、各種cDNA反轉錄的方法和不同的逆轉錄酶。這導致了不同實驗室報告的RT-qPCR結果可能不一致，而且很難確定哪些結果是真實的，哪些結果是錯誤的，尤其是在沒有足夠的分析設計參數和實驗方案信息的情況下。

03PCR步驟

聚合酶鏈反應的穩定性并不像看上去那么好，這有幾個原因：

a.許多已發表的PCR分析要么設計不充分，不可能只擴增預期的目標，要么發表的信息不正確，導致發表錯誤的引物或探針序列；

b.最佳的PCR性能在很大程度上取決于適當的模板制備方法；

c.認為qPCR檢測分辨率足夠高的假設是錯誤的。

d.不同制造商的“定量PCR預混液”是不同的，不同預混液可能會影響最后的“差異倍數”值；

e.對于一些目的基因，選擇一步法RT-qPCR和兩步法RT-qPCR也會造成結果的不一致；

f.許多商業化熱啟動Taq在熱啟動前似乎沒有經制造商的封閉性測試，容易產生非特異性擴增，形成引物二聚體；

g.目的基因和內參基因的擴增效率不在線性范圍內，而且二者的擴增效率也不一致，這極大影響了實驗結果的真實性。

規范操作建議

01引物和探針的驗證

由于任何PCR檢測的特異性和效率都嚴重依賴于引物和探針，如果使用，這些都需要仔細檢查。實際應用中有頻繁的錯誤，包括簡單的排版錯誤，對寡核苷酸序列取向混亂，缺乏特異性的引物，設計跨內含子的PCR擴增子。