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基于模塊化設計的 DNA 高通量組裝助力合成生物學研究

合成生物學是一門交叉學科，未來很有可能對學術和工業方面的應用產生重大的影響，包括生產新型治療藥物和疫苗、植物科學和生物燃料。其中許多學科都需要利用基于生物學的化工生產能力，將工程學原理應用于生物學。其重點通常是從天然生物系統中產生、表征和分離某些天然物質（如 DNA），并將其用作工程化生物路徑的組件。合成生物學的特點是將理性原則應用于這些生物組件的設計和組裝，但即便是理性設計，引入外源 DNA 到細胞中的影響也很難預測，這就需要測試多種排列組合以獲得期望的結果。加強對 DNA 片段的模塊化設計，就可以通過替換單個組件的方式來實現多樣化的潛在的組裝構建。DNA 片段的模塊化設計和組裝不僅可以簡化整體的 DNA 構建工作流程，還使自動化組裝成為可能，減少完成多次構建所需的時間、人力和成本，從而提高通量，并縮短總體開發周期。

NEBuilder? 高保真 DNA 組裝和 NEBridge? Golden Gate 組裝引領著下一代克隆技術。這兩種方法都兼容高通量工作流程，并已經成功通過自動化平臺（例如 Labcyte?, Inc. 的 Echo? 525 液體處理系統和 SPT Labtech 的mosquito? LV 移液工作站）實現了高通量無縫克隆。

無縫組裝結合 Labcyte?, Inc. 的 Echo? 525 液體處理系統

使用納升級聲波移液系統實現 PIK3CA 的模塊化 DNA 組裝

在此研究中，NEBuilder? HiFi 與 25 nL 移液量的 Labcyte Echo? 525 液體處理系統結合使用，來完成基于五個模塊化片段，可以編碼 PIK3CA 癌基因的組裝構建。將這些模塊設計為分別包含發生于野生型 PIK3CA 上的四個活化突變：R38H、E542K、E545K 和 H1047R，將其克隆到 pcDNA?3.1/Zeo(+) 載體上，組裝成 8,940 bp 大小的質粒。本實驗的目標是利用 Echo 525 液體處理系統，在納升級別上完成五組五個片段的模塊化 DNA 組裝。該實驗通過 junction 菌落 qPCR 快速分析驗證是否組裝成功，并通過 Illumina? MiSeq? 測序進行核苷酸水平上的驗證。

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微型化多片段 DNA 組裝

在此應用案例描述的研究中，NEB NEBuilder? 高保真 DNA 組裝克隆試劑盒與 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統結合使用，基于五個模塊化片段進行 DNA 組裝構建。反應體積可以縮小到說明書推薦體積的 1/40，從而顯著節省試劑成本。在轉化到大腸桿菌之中后，首先通過 junction 菌落 qPCR 檢查組裝構建是否成功，然后，采用微型化的 Illumina? MiSeq? Nextera XT 方案進行測序驗證，從而進一步節省成本。

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利用 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統和 NEBuilder 高保真克隆試劑盒進行納升級DNA 組裝

在該實驗中，將 NEBuilder? 高保真組裝試劑盒與 25 nL 移液量的 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統相結合使用。通過組裝構建兩種獨特的質粒，展示了基于合理設計的模塊化合成生物學的優勢。第一種組裝包含兩個片段，設計構建可以表達 LacZ 通路的 5223 bp 大小的質粒，并在轉化到非 α 互補的菌株中時，能夠進行藍白斑篩選。第二種組裝由五個片段構建 8,940 bp 大小的質粒，更接近典型工業 DNA 生產的復雜性和大小。兩片段組裝成功從 20 μL 推薦體積縮小到 100 nL，試劑用量只有原來的 1/200。對于更復雜的組裝，反應體積成功降至原來的 1/80，而降至 1/40 時可以得到最穩健的結果。當反應體積減小到 1/40 時，總反應體積為 500 nL，每種 DNA 片段只需要 1.25 fmoles 的加入量。這些實驗的目標是利用 Echo 525 液體處理系統，通過微量反應體積，完成兩個片段和五個片段的組裝構建。通過 junction qPCR 快速分析驗證組裝是否成功，并通過 Sanger 測序在核苷酸水平上進行驗證。

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無縫組裝結合 SPT Labtech 的 mosquito? LV 移液工作站

基于自動化高密度樣本存儲與微型化液體處理系統的高通量合成生物學組裝構建

本應用案例描述了一種自動化、高通量的工作流程，該工作流程已由 GeneMill 合成生物學服務中心（由 James Johnson 博士領導，位于利物浦大學）集成用于構建合成 DNA。

通過將 arktic 自動化樣本管理系統與 mosquito X1/LV 小體積液體處理系統相結合，可以簡化和加速 GeneMill 現有的手動工作流程。這拓展了該核心機構的 DNA 合成能力，有助于合成生物學研究人員獲得更多經過驗證的實驗工具。

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NEB 正在不斷將 NEBuilder? 高保真 DNA 無縫組裝和 NEBridge? Golden Gate 無縫組裝結合更多的自動化平臺、多種組裝構建設計和應用場景進行測試驗證，致力于以低成本的方法和工作流程，構建高質量的合成 DNA，從而以較高的通量拓展基于設計的實驗測試，并為科學家的研究提供更豐富的生物學場景。