Dam (G^mATC), Dcm (C^mCWGG) 和 CpG (^mCG) 甲基化             

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，它能將 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤或胞嘧啶上。當(dāng)使用限制性內(nèi)切酶消化 DNA 時，要考慮 DNA 是否有甲基化的問題，因為如果識別序列中某個特定堿基被甲基化后，切割就會被完全或者不完全阻斷。

原核生物甲基化

在原核生物中，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶作為限制修飾系統(tǒng)的一個組成部分廣泛存在，它們的作用是保護(hù)宿主菌不被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割。大多數(shù)實驗室使用的大腸桿菌表達(dá)三種位點特異性的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。

? Dam 甲基轉(zhuǎn)移酶能將甲基轉(zhuǎn)移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N⁶ 位點上（1,2）。

? Dcm 甲基轉(zhuǎn)移酶能在 CCAGG 和 CCTGG（1,3）序列內(nèi)部的胞嘧啶 C⁵ 位置上甲基化。

? EcoKI 甲基轉(zhuǎn)移酶可將 AAC (N⁶A) GTGC 和 GCAC (N⁶A) GTT 上的腺嘌呤進(jìn)行甲基化修飾。

如果限制性內(nèi)切酶的切割對象是從表達(dá) Dam 或 Dcm 甲基轉(zhuǎn)移酶的菌株中分離而得，并且其甲基化識別位點與內(nèi)切酶識別位點有重疊，那么該限制性內(nèi)切酶的部分或全部酶切位點有可能被阻斷。例如，從 dam⁺ E. coli 中分離的質(zhì)粒 DNA 完全不能被識別序列為 GATC 的 MboI 所切割。

E. coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全甲基化（因此完全不能被 MboI 切割)，而 λDNA 只有大約 50% 的 Dam 位點被甲基化，這是因為在 λ DNA 被包裝到噬菌體頭部之前，甲基化酶還沒來得及將 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻斷的內(nèi)切酶只能對這些 λ DNA 進(jìn)行部分切割。

被 Dam 或 Dcm 甲基化阻斷的限制性位點可以通過克隆方法去甲基化，即將 DNA 轉(zhuǎn)至 dam^-/dcm^-  菌株中進(jìn)行繁殖 [如 dam^- /dcm^- E. coli 感受態(tài)細(xì)胞（NEB #C2925）]。

如果出現(xiàn)重疊位點，內(nèi)切酶酶切也會被阻斷。在這種情況下，Dam 或者 Dcm 序列一部分來自內(nèi)切酶識別序列，另一部分為識別序列左右旁側(cè)的序列。在設(shè)計內(nèi)切酶酶切時也應(yīng)考慮到這種情況。

真核生物甲基化

在高等真核生物（如 Dnmt1）中發(fā)現(xiàn)的 CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶（CpG MTases），能將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至胞嘧啶殘基上的 C⁵ 位點。CpG 甲基化形式受遺傳因素的影響，具有組織特異性，并與基因表達(dá)相關(guān)。因此，我們推測CpG 甲基化在基因分化和表達(dá)中起了一定的作用（4）。

注意：在消化真核基因組 DNA 時尤其要關(guān)注 CpG 甲基化的影響。需要注意的是，一旦 DNA 被克隆到細(xì)菌中后，將不存在 CpG 甲基化形式。

甲基化敏感性

下表總結(jié)了NEB 限制性內(nèi)切酶的甲基化敏感性，表中列出了內(nèi)切酶識別位點被 Dam、Dcm或 CpG 甲基化后內(nèi)切酶的切割是否被阻斷或消弱。本表只對酶的特性提供參考信息，不能作為絕對依據(jù)。若想了解更多詳細(xì)信
息以及本指南所基于的特定例子，請登陸限制性內(nèi)切酶 REBASE 數(shù)據(jù)庫
( http://rebase.neb.com/rebase/ )。 

 參考文獻(xiàn)：

(1) Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol.,114, 1143–1150.

(2) Geier, G.E. and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem.,254, 1408–1413.

(3) May, M.S. and Hattman, S. (1975) J. Bacteriol.,123, 768–770.

(4) Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol., 7,r305–307.